RT-qPCR的引物获取有时就这么简单

灵敏的PCR反应，决定于所使用引物的特异性。特别是用于定量分析的基于Sybr green染料的 RT-qPCR，引物更是重中之重。初学者在师兄师姐们带领下学习理解RT-qPCR技术时，可能更多是关注数据分析结果展示之类，而对引物的重要性认识不够；在认识到引物的重要后，又往往去找各种引物设计软件或是网上数据库的使用教程，期以知道如何设计和获取qPCR引物。

实际上，笔者认为，在2018年的今天，如果我们检测的基因不是太新颖，我们也不用真的去关心引物的设计原则。

根据经验，笔者推荐如下的顺序进行qPCR引物获取。

所需材料：

1、 一台连网电脑

2、 可以上google

初级：直接获取

优点：退火温度统一为60，适合二步法，节约时间。

缺点：物种只有人和小鼠。

在直接获取方面，一般人会是想到的是Primerbank、GETPrime、qPrimerDB、RTPrimerDB之类由学术界提供的网上数据库。这是一个很好的方法，很多公众号也在进行介绍，不少实验室的人也是这么做的。我个人认为，生物公司要提供的会比由学术界预测收集的要好一些。只是大部分提供RT-qPCR引物的公司，并不会主动提供引物序列消息。但总有例外，比如http://www.origene.com.cn/qPCR/primers.aspx，就会免费提供人和小鼠常见基因的RT-qPCR引物序列。下面以人的IFNG基因为例，在打开的网页上直接输入“IFNG”，并点击GO。

得到引物序列后，可以在Primerblast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）进行验证。

更有趣的是，把这个序列在Google上搜索，得到85条结果

简单看一下，还会发现找到的一些文章中有不少与IFNG研究相近的基因引物。点击打开第一篇文章

可以在文章中发现同时有IL-10的引物。如果是用人的PBMC作为实验材料的人，可以直接使用这些引物了。

进阶篇：建立个性化RT-qPCR引物数据库

网络上的引物千千万，文章中的序列数不清，但我们真正需要的只是能在我们实验条件下能work的一条。而我们的实验条件包括实验材料（细胞系或原代细胞或组织）、实验条件（退火温度）。基于此，有必要建立起个性化的RT-qPCR引物数据库。比如，以上的“HPRT Forward primer 5′-GAACGTCTTGCTCGAGATGTG-3′ and reverse primer 5′-CCAGCAGGTCAGCAAAGAATT-3′。在Google中可以找到很多附件，里面就是包括了不少引物序列。而我们要做的是，下载其中的附件，对引物进行评价，并按下表建立起个性化的数据库。另外也可以收集平时看到的文章中的序列，并记录下基中RNA来源，所用试剂和反应条件等信息建库。在进行实验时，在个性化数据库中找到最符合自己实验条件的那条序列。

弱水三千，只取一瓢，引物也是适合的才是最好。

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备注：入群学习

从以下20个热点入手，每天给大家分享干货：

1	miRNA非经典机制	11	肠道菌群
2	lncRNA的10种机制	12	细胞自噬
3	circRNA	13	细胞焦亡、铁死亡
4	ceRNA	14	间充质干细胞
5	转录因子	15	肿瘤干细胞
6	可变剪接	16	外泌体
7	SNP	17	氧化应激
8	泛素化修饰	18	调节性T细胞
9	组蛋白修饰	19	RNA甲基化修饰
10	蛋白激酶和磷酸酶	20	肿瘤微环境

而这些研究方向参与疾病发生发展过程的分子机制，可以归纳总结为一下几类研究：

①分子（DNA、RNA、蛋白质、小分子）的表观遗传修饰；

②分子拷贝数的表达变化差异；

③RNA分子的剪接加工、出核、细胞组织水平的时空变化研究；

④特殊的一群细胞类型研究、细胞通讯微环境研究；

⑤具有临床应用潜力的新技术（CRIPSR）或者载体（膜结构、细胞等）；

⑥关注细胞生理学现象：自噬、凋亡、线粒体失功等；

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